一、操作流程：
（一）工作液体配制：
1）Fluo-4工作液配制：
每管Fluo-4 AM：+8μlDMSO +2μlF-127
2）Fluo-4工作液使用（0.5-5uM）
储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1μlFluo-4工作液
3）Fluo-4指示剂孵育：
将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000μlFluo-4溶液，37℃孵育20min。
4）清洗：
将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最后加上相应的浴液开始拍摄。
（二）钙离子成像：
将待测样品放在显微镜载物台上观察，通过钙离子检测系统进行实时监测测定。在相同的环境下（同一光学系统、同一温度、恒定的曝光时间等） 激发成像，测定一定时间序列胞内钙离子的荧光强度Ratio 和钙离子浓度的变化。 使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。
以Leica MI8为例：
采用xyt时间轴拍摄模式：Time interval：3s；Frames：200（根据实验而定）。
1） 开机：先开硬件，再开软件。
开机顺序：按照显微镜电源，LED荧光电源，摄像机电源，电脑电源，依次打开。
2）启动徕卡LAS X软件
! 注意!
请不要在显微镜等相关硬件没有开启的情况下启动软件！
（1） 双击电脑桌面上LAS X图标启动LAS X。
徕卡LAS X 系统开始运行。
使用徕卡LAS X进行图像采集时参数的设置方法。
点击Acquire箭形图标后再点击Acquisition，就可以在Acquisition mode菜单中进行设置了：
x和y按钮总是处于激活状态。
激活z按钮即可进行三维图像采集的设置。（钙成像不需对z进行设置，勿动。）
激活t按钮即可打开t-菜单，进行时间序列采图的条件设置。
（3）光路设置
光路设置菜单位于LAS X界面的左边。通过该菜单可以对不同实验进行光路设置。
当
图标处于激活状态，就可以开始进行光路设置了。从第一个通道开始：
双击
，从LUT (色彩查找表)中选择对应的颜色
从反差方式（Contrast Method）窗口选择您需要的对比方式。在荧光滤色块窗口选择需要的荧光滤色块。
其他通道可以通过点击"+" 按钮来创建，也可以点击"-"按钮删除不需要的通道。如果想要改变通道的顺序，可以点击对应通道右键选择移动（以 FCr 1为例）。
您可以自由定义多达8个通道。且可以点击右键保存您选择的通道的设置。保存的通道在以后的实验还可以调用。
所有通道的组合包括采集参数都可以通过Load/Save Settings菜单来保存并可以从中调用已保存设置。
(4)Image菜单
Image菜单用来设置摄像头相关参数：
最重要的参数是Binning和Exposure曝光时间。
Binning 是将几个像素加起来作为一个像素读出以提高灵敏度。比如Binning 2x2就是4个像素联合起来 (x方向2个像素*y方向2个像素)。
这会使图像分辨率降低4倍。一般采图会选择Binning 2。
Exposure 曝光时间滑块可以对每个通道的曝光时间分别设置。Gain设置摄像头的电子增益。
Intensity 为照明光路的光强设置。
（5）t-菜单 时间序列采图
点击，t-菜单即被激活，可进行时间序列图像采集的设置:
选择Cycle则可定义所需的图像采集帧数。
选择Duration，可定义采图总时间。
选择Acquire until Stopped 则实验没有明确的结束时间，图像将持续采集直至点击stop来终止。
Time Interval（采集相邻两帧图像的时间间隔）可以在输入框中定义（定义的时间间隔大于Minimize值）。
如果Minimize被激活了，则图像采集时会按照最短时间间隔来执行。
（三）、数据图像处理
1）保存软件生成的LIF文件。（非常重要）
2） 在电脑上成像后，建立背景 ROI，计算背景光密度值 Fb 以扣除背景。
3） 通过软件自动识别细胞样品，建立样品 ROI 区域。
4）实时输出细胞的荧光光密度比率变化曲线图和游离 Ca2+的浓度变化曲线图 ，并存储数据。
（四）、关机
关机时先关闭软件再关闭，与开机时顺序相反。
二、注意事项：
1、该仪器应避免灰尘、潮湿、过冷、过热（要求：环境温度10-36℃，湿度≤70%）及酸、碱性蒸汽等；
2、室内不允许存放化学药品，更不得将镜头存放在装有化学药品的容器内；
3、分析完毕，清理现场。显微镜的物镜及目镜光学表面可以使用棉签蘸取无水乙醇清洁。
4、在放置培养板时，轻拿轻放，避免液体溅落在镜头上，万一溅落请立即擦拭干净！
5、使用的给药灌流装置，在实验结束后必须使用过滤过的纯水进行冲洗！！不得少于3遍！
